高效液相色譜HPLC系統(tǒng)一般由輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、數(shù)據(jù)記錄及處理裝置等組成。其中輸液泵、色譜柱、檢測(cè)器是關(guān)鍵部件。

高效液相色譜HPLC系統(tǒng)一般由輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、數(shù)據(jù)記錄及處理裝置等組成。其中輸液泵、色譜柱、檢測(cè)器是關(guān)鍵部件。

下面介紹高效液相色譜HPLC系統(tǒng)之輸液泵的構(gòu)造、性能、使用和維護(hù)注意事項(xiàng)、梯度洗脫等。

泵的構(gòu)造和性能

輸液泵是HPLC系統(tǒng)中最重要的部件之一。泵的性能好壞直接影響到整個(gè)系統(tǒng)的質(zhì)量和分析結(jié)果的可靠性。輸液泵應(yīng)具備如下性能：①流量穩(wěn)定，其RSD應(yīng)＜0.5%，這對(duì)定性定量的準(zhǔn)確性至關(guān)重要；②流量范圍寬，分析型應(yīng)在0.1~10 ml/min范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)，制備型應(yīng)能達(dá)到100 ml/min；③輸出壓力高，一般應(yīng)能達(dá)到150~300kg/cm2；④液缸容積?。虎菝芊庑阅芎?，耐腐蝕。

泵的種類(lèi)很多，按輸液性質(zhì)可分為恒壓泵和恒流泵。恒流泵按結(jié)構(gòu)又可分為螺旋注射泵、柱塞往復(fù)泵和隔膜往復(fù)泵。恒壓泵受柱阻影響，流量不穩(wěn)定；螺旋泵缸體太大，這兩種泵已被淘汰。目前應(yīng)用最多的是柱塞往復(fù)泵。

柱塞往復(fù)泵的液缸容積小，可至0.1ml，因此易于清洗和更換流動(dòng)相，特別適合于再循環(huán)和梯度洗脫；改變電機(jī)轉(zhuǎn)速能方便地調(diào)節(jié)流量，流量不受柱阻影響；泵壓可達(dá)400kg/cm2。其主要缺點(diǎn)是輸出的脈沖性較大，現(xiàn)多采用雙泵系統(tǒng)來(lái)克服。雙泵按連接方式可分為并聯(lián)式和串聯(lián)式，一般說(shuō)來(lái)并聯(lián)泵的流量重現(xiàn)性較好（RSD為0.1%左右，串聯(lián)泵為0.2~0.3%），但出故障的機(jī)會(huì)較多（因多一單向閥），價(jià)格也較貴。

泵的使用和維護(hù)注意事項(xiàng)

為了延長(zhǎng)泵的使用壽命和維持其輸液的穩(wěn)定性，必須按照下列注意事項(xiàng)進(jìn)行操作：

①防止任何固體微粒進(jìn)入泵體，因?yàn)閴m?；蚱渌魏坞s質(zhì)微粒都會(huì)磨損柱塞、密封環(huán)、缸體和單向閥，因此應(yīng)預(yù)先除去流動(dòng)相中的任何固體微粒。流動(dòng)相最好在玻璃容器內(nèi)蒸餾，而常用的方法是濾過(guò)，可采用Millipore濾膜（0.2µm或0.45µm）等濾器。泵的入口都應(yīng)連接砂濾棒（或片）。輸液泵的濾器應(yīng)經(jīng)常清洗或更換。

②流動(dòng)相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)，含有緩沖液的流動(dòng)相不應(yīng)保留在泵內(nèi)，尤其是在停泵過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間的情況下。如果將含緩沖液的流動(dòng)相留在泵內(nèi)，由于蒸發(fā)或泄漏，甚至只是由于溶液的靜置，就可能析出鹽的微細(xì)晶體，這些晶體將和上述固體微粒一樣損壞密封環(huán)和柱塞等。因此，必須泵入純水將泵充分清洗后，再換成適合于色譜柱保存和有利于泵維護(hù)的溶劑（對(duì)于反相鍵合硅膠固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。

③泵工作時(shí)要留心防止溶劑瓶?jī)?nèi)的流動(dòng)相被用完，否則空泵運(yùn)轉(zhuǎn)也會(huì)磨損柱塞、缸體或密封環(huán)，最終產(chǎn)生漏液。

④輸液泵的工作壓力決不要超過(guò)規(guī)定的最高壓力，否則會(huì)使高壓密封環(huán)變形，產(chǎn)生漏液。

⑤流動(dòng)相應(yīng)該先脫氣，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性，如果有大量氣泡，泵就無(wú)法正常工作。

如果輸液泵產(chǎn)生故障，須查明原因，采取相應(yīng)措施排除故障：

①?zèng)]有流動(dòng)相流出，又無(wú)壓力指示。原因可能是泵內(nèi)有大量氣體，這時(shí)可打開(kāi)泄壓閥，使泵在較大流量（如5ml/min）下運(yùn)轉(zhuǎn)，將氣泡排盡，也可用一個(gè)50ml針筒在泵出口處幫助抽出氣體。另一個(gè)可能原因是密封環(huán)磨損，需更換。

②壓力和流量不穩(wěn)。原因可能是氣泡，需要排除；或者是單向閥內(nèi)有異物，可卸下單向閥，浸入丙酮內(nèi)超聲清洗。有時(shí)可能是砂濾棒內(nèi)有氣泡，或被鹽的微細(xì)晶?；蜃躺奈⑸锊糠侄氯?，這時(shí)，可卸下砂濾棒浸入流動(dòng)相內(nèi)超聲除氣泡，或?qū)⑸盀V棒浸入稀酸（如4mol/L硝酸）內(nèi)迅速除去微生物，或?qū)Ⅺ}溶解，再立即清洗。

③壓力過(guò)高的原因是管路被堵塞，需要清除和清洗。壓力降低的原因則可能是管路有泄漏。檢查堵塞或泄漏時(shí)應(yīng)逐段進(jìn)行。

梯度洗脫

HPLC有等強(qiáng)度(isocratic)和梯度(gradient)洗脫兩種方式。等度洗脫是在同一分析周期內(nèi)流動(dòng)相組成保持恒定，適合于組分?jǐn)?shù)目較少，性質(zhì)差別不大的樣品。梯度洗脫是在一個(gè)分析周期內(nèi)程序控制流動(dòng)相的組成，如溶劑的極性、離子強(qiáng)度和pH值等，用于分析組分?jǐn)?shù)目多、性質(zhì)差異較大的復(fù)雜樣品。采用梯度洗脫可以縮短分析時(shí)間，提高分離度，改善峰形，提高檢測(cè)靈敏度，但是常常引起基線漂移和降低重現(xiàn)性。

梯度洗脫有兩種實(shí)現(xiàn)方式：低壓梯度（外梯度）和高壓梯度（內(nèi)梯度）。

兩種溶劑組成的梯度洗脫可按任意程度混合，即有多種洗脫曲線：線性梯度、凹形梯度、凸形梯度和階梯形梯度。線性梯度最常用，尤其適合于在反相柱上進(jìn)行梯度洗脫。

在進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，由于多種溶劑混合，而且組成不斷變化，因此帶來(lái)一些特殊問(wèn)題，必須充分重視：

①要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動(dòng)相。有些溶劑在一定比例內(nèi)混溶，超出范圍后就不互溶，使用時(shí)更要引起注意。當(dāng)有機(jī)溶劑和緩沖液混合時(shí)，還可能析出鹽的晶體，尤其使用磷酸鹽時(shí)需特別小心。

②梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證良好的重現(xiàn)性。進(jìn)行樣品分析前必須進(jìn)行空白梯度洗脫，以辨認(rèn)溶劑雜質(zhì)峰，因?yàn)槿跞軇┲械碾s質(zhì)富集在色譜柱頭后會(huì)被強(qiáng)溶劑洗脫下來(lái)。用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣，以防止混合時(shí)產(chǎn)生氣泡。

③混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因而在梯度洗脫時(shí)常出現(xiàn)壓力的變化。例如甲醇和水粘度都較小，當(dāng)二者以相近比例混合時(shí)粘度增大很多，此時(shí)的柱壓大約是甲醇或水為流動(dòng)相時(shí)的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過(guò)程中壓力超過(guò)輸液泵或色譜柱能承受的最大壓力。

④每次梯度洗脫之后必須對(duì)色譜柱進(jìn)行再生處理，使其恢復(fù)到初始狀態(tài)。需讓10~30倍柱容積的初始流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱，使固定相與初始流動(dòng)相達(dá)到完全平衡。

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