輸液泵、色譜柱、檢測(cè)器是高效液相色譜HPLC系統(tǒng)關(guān)鍵部件。檢測(cè)器的作用是把洗脫液中組分的量轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)。HPLC的檢測(cè)器要求靈敏度高、噪音低（即對(duì)溫度、流量等外界變化不敏感）、線性范圍寬、重復(fù)性好和適用范圍廣。

高效液相色譜HPLC系統(tǒng)一般由輸液泵、進(jìn)樣器、HPLC系統(tǒng)色譜柱、檢測(cè)器、數(shù)據(jù)記錄及處理裝置等組成。其中輸液泵、色譜柱、檢測(cè)器是關(guān)鍵部件。有的儀器還有梯度洗脫裝置、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、預(yù)柱或保護(hù)柱、柱溫控制器等，現(xiàn)代HPLC儀還有微機(jī)控制系統(tǒng)，進(jìn)行自動(dòng)化儀器控制和數(shù)據(jù)處理。制備型HPLC儀還備有自動(dòng)餾分收集裝置。

檢測(cè)器是HPLC儀的三大關(guān)鍵部件之一。其作用是把洗脫液中組分的量轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)。HPLC的檢測(cè)器要求靈敏度高、噪音低（即對(duì)溫度、流量等外界變化不敏感）、線性范圍寬、重復(fù)性好和適用范圍廣。

本文從以下幾方面介紹檢測(cè)器：分類(lèi)、性能指標(biāo)、紫外檢測(cè)器(ultraviolet detector)、檢測(cè)器的故障及排除、恒溫裝置、數(shù)據(jù)處理和計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)。

一、分類(lèi)

a、按原理可分為光學(xué)檢測(cè)器（如紫外、熒光、示差折光、蒸發(fā)光散射）、熱學(xué)檢測(cè)器（如吸附熱）、電化學(xué)檢測(cè)器（如極譜、庫(kù)侖、安培）、電學(xué)檢測(cè)器（電導(dǎo)、介電常數(shù)、壓電石英頻率）、放射性檢測(cè)器（閃爍計(jì)數(shù)、電子捕獲、氦離子化）以及氫火焰離子化檢測(cè)器。

b、按測(cè)量性質(zhì)可分為通用型和專(zhuān)屬型（又稱(chēng)選擇性）。通用型檢測(cè)器測(cè)量的是一般物質(zhì)均具有的性質(zhì)，它對(duì)溶劑和溶質(zhì)組分均有反應(yīng)，如示差折光、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器。通用型的靈敏度一般比專(zhuān)屬型的低。專(zhuān)屬型檢測(cè)器只能檢測(cè)某些組分的某一性質(zhì)，如紫外、熒光檢測(cè)器，它們只對(duì)有紫外吸收或熒光發(fā)射的組分有響應(yīng)。

c、按檢測(cè)方式分為濃度型和質(zhì)量型。濃度型檢測(cè)器的響應(yīng)與流動(dòng)相中組分的濃度有關(guān)，質(zhì)量型檢測(cè)器的響應(yīng)與單位時(shí)間內(nèi)通過(guò)檢測(cè)器的組分的量有關(guān)。

d、檢測(cè)器還可分為破壞樣品和不破壞樣品的兩種。

二、性能指標(biāo)

a、噪音和漂移：在儀器穩(wěn)定之后，記錄基線1小時(shí)，基線帶寬為噪音，基線在1小時(shí)內(nèi)的變化為漂移。它們反映檢測(cè)器電子元件的穩(wěn)定性，及其受溫度和電源變化的影響，如果有流動(dòng)相從色譜柱流入檢測(cè)器，那么它們還反映流速（泵的脈動(dòng)）和溶劑（純度、含有氣泡、固定相流失）的影響。噪音和漂移都會(huì)影響測(cè)定的準(zhǔn)確度，應(yīng)盡量減小。

b、靈敏度(sensitivity)：表示一定量的樣品物質(zhì)通過(guò)檢測(cè)器時(shí)所給出的信號(hào)大小。對(duì)濃度型檢測(cè)器，它表示單位濃度的樣品所產(chǎn)生的電信號(hào)的大小，單位為mV·ml/g。對(duì)質(zhì)量型檢測(cè)器，它表示在單位時(shí)間內(nèi)通過(guò)檢測(cè)器的單位質(zhì)量的樣品所產(chǎn)生的電信號(hào)的大小，單位為mV·s/g。

c、檢測(cè)限(detection limit)

檢測(cè)器靈敏度的高低，并不等于它檢測(cè)最小樣品量或最低樣品濃度能力的高低，因?yàn)樵诙x靈敏度時(shí)，沒(méi)有考慮噪聲的大小，而檢測(cè)限與噪聲的大小是直接有關(guān)的。

檢測(cè)限指恰好產(chǎn)生可辨別的信號(hào)（通常用2倍或3倍噪音表示）時(shí)進(jìn)入檢測(cè)器的某組分的量（對(duì)濃度型檢測(cè)器指在流動(dòng)相中的濃度--注意與分析方法檢測(cè)限的區(qū)別，單位g/ml或mg/ml；對(duì)質(zhì)量型檢測(cè)器指的是單位時(shí)間內(nèi)進(jìn)入檢測(cè)器的量，單位g/s或mg/s）。又稱(chēng)為敏感度(detectability)。D＝2N/S，式中N為噪聲，S為靈敏度。通常是把一個(gè)已知量的標(biāo)準(zhǔn)溶液注入到檢測(cè)器中來(lái)測(cè)定其檢測(cè)限的大小。

檢測(cè)限是檢測(cè)器的一個(gè)主要性能指標(biāo)，其數(shù)值越小，檢測(cè)器性能越好。值得注意的是，分析方法的檢測(cè)限除了與檢測(cè)器的噪聲和靈敏度有關(guān)外，還與色譜條件、色譜柱和泵的穩(wěn)定性及各種柱外因素引起的峰展寬有關(guān)。

d、線性范圍(linear range)：指檢測(cè)器的響應(yīng)信號(hào)與組分量成直線關(guān)系的范圍，即在固定靈敏度下，最大與最小進(jìn)樣量（濃度型檢測(cè)器為組分在流動(dòng)相中的濃度）之比。也可用響應(yīng)信號(hào)的最大與最小的范圍表示，例如Waters 996 PDA檢測(cè)器的線性范圍是-0.1~2.0A。

定量分析的準(zhǔn)確與否，關(guān)鍵在于檢測(cè)器所產(chǎn)生的信號(hào)是否與被測(cè)樣品的量始終呈一定的函數(shù)關(guān)系。輸出信號(hào)與樣品量最好呈線性關(guān)系，這樣進(jìn)行定量測(cè)定時(shí)既準(zhǔn)確又方便。但實(shí)際上沒(méi)有一臺(tái)檢測(cè)器能在任何范圍內(nèi)呈線性響應(yīng)。通常A＝BCx，B為響應(yīng)因子，當(dāng)x=1時(shí)，為線性響應(yīng)。對(duì)大多數(shù)檢測(cè)器來(lái)說(shuō)，x只在一定范圍內(nèi)才接近于1，實(shí)際上通常只要x=0.98~1.02就認(rèn)為它是呈線性的。

線性范圍一般可通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定。我們希望檢測(cè)器的線性范圍盡可能大些，能同時(shí)測(cè)定主成分和痕量成分。此外還要求池體積小，受溫度和流速的影響小，能適合梯度洗脫檢測(cè)等。

e、池體積：除制備色譜外，大多數(shù)HPLC檢測(cè)器的池體積都小于10ul。在使用細(xì)管徑柱時(shí)，池體積應(yīng)減少到1~2ul甚至更低，不然檢測(cè)系統(tǒng)帶來(lái)的峰擴(kuò)張問(wèn)題就會(huì)很?chē)?yán)重。而且這時(shí)池體、檢測(cè)器與色譜柱的連接、接頭等都要精心設(shè)計(jì)，否則會(huì)嚴(yán)重影響柱效和靈敏度。

三、紫外檢測(cè)器(ultraviolet detector)

UV檢測(cè)器是HPLC中應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)器，當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)范圍包括可見(jiàn)光時(shí)，又稱(chēng)為紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器。它靈敏度高，噪音低，線性范圍寬，對(duì)流速和溫度均不敏感，可于制備色譜。由于靈敏高，因此既使是那些光吸收小、消光系數(shù)低的物質(zhì)也可用UV檢測(cè)器進(jìn)行微量分析。但要注意流動(dòng)相中各種溶劑的紫外吸收截止波長(zhǎng)。如果溶劑中含有吸光雜質(zhì)，則會(huì)提高背景噪音，降低靈敏度（實(shí)際是提高檢測(cè)限）。此外，梯度洗脫時(shí)，還會(huì)產(chǎn)生漂移。

注：將溶劑裝入1cm的比色皿，以空氣為參比，逐漸降低入射波長(zhǎng)，溶劑的吸光度A＝1時(shí)的波長(zhǎng)稱(chēng)為溶劑的截止波長(zhǎng)。也稱(chēng)極限波長(zhǎng)。

中國(guó)藥典對(duì)UV法溶劑的要求是：以空氣為空白，溶劑和吸收池的吸收度在220~240nm范圍內(nèi)不得超過(guò)0.40，在241~250nm范圍內(nèi)不得過(guò)0.20，在251~300nm范圍內(nèi)不得過(guò)0.10，在300nm以上不得過(guò)0.05。

UV檢測(cè)器的工作原理是Lambert-Beer定律，即當(dāng)一束單色光透過(guò)流動(dòng)池時(shí)，若流動(dòng)相不吸收光，則吸收度A與吸光組分的濃度C和流動(dòng)池的光徑長(zhǎng)度L成正比.

UV檢測(cè)器分為固定波長(zhǎng)檢測(cè)器、可變波長(zhǎng)檢測(cè)器和光電二極管陣列檢測(cè)器(photodiode array detector，PDAD)。按光路系統(tǒng)來(lái)分，UV檢測(cè)器可分為單光路和雙光路兩種。可變波長(zhǎng)檢測(cè)器又可分單波長(zhǎng)（單通道）檢測(cè)器和雙波長(zhǎng)（雙通道）檢測(cè)器。PDAD是80年代出現(xiàn)的一種光學(xué)多通道檢測(cè)器，它可以對(duì)每個(gè)洗脫組分進(jìn)行光譜掃描，經(jīng)計(jì)算機(jī)處理后，得到光譜和色譜結(jié)合的三維圖譜。其中吸收光譜用于定性（確證是否是單一純物質(zhì)），色譜用于定量。常用于復(fù)雜樣品（如生物樣品、中草藥）的定性定量分析。

四、檢測(cè)器的故障及排除

a、流動(dòng)池內(nèi)有氣泡

如果有氣泡連續(xù)不斷地通過(guò)流動(dòng)池，將使噪音增大，如果氣泡較大，則會(huì)在基線上出現(xiàn)許多線狀"峰"，這是由于系統(tǒng)內(nèi)有氣泡，需要對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行充分的除氣，檢查整個(gè)色譜系統(tǒng)是否漏氣，再加大流量驅(qū)除系統(tǒng)內(nèi)的氣泡。如果氣泡停留在流動(dòng)池內(nèi)，也可能使噪音增大，可采用突然增大流量的辦法除去氣泡（最好不連接色譜柱）；或者啟動(dòng)輸液泵的同時(shí)，用手指緊壓流動(dòng)池出口，使池內(nèi)增壓，然后放開(kāi)?？煞磸?fù)操作數(shù)次，但要注意不使壓力增加太多，以免流動(dòng)池破裂。

b、流動(dòng)池被污染

無(wú)論參比池或樣品池被污染，都可能產(chǎn)生噪音或基線漂移。可以使用適當(dāng)溶劑清洗檢測(cè)池，要注意溶劑的互溶性；如果污染嚴(yán)重，就需要依次采用1mol/L硝酸、水和新鮮溶劑沖洗，或者取出池體進(jìn)行清洗、更換窗口。

c、光源燈出現(xiàn)故障

紫外或熒光檢測(cè)器的光源燈使用到極限或者不能正常工作時(shí)，可能產(chǎn)生嚴(yán)重噪音，基線漂移，出現(xiàn)平頭峰等異常峰，甚至使基線不有回零。這時(shí)需要更換光源燈。

d、倒峰

倒峰的出現(xiàn)可能是檢測(cè)器的極性接反了，改正后即可變成正峰。用示差折光檢測(cè)器時(shí)，如果組分的折光指數(shù)低于流動(dòng)相的折光指數(shù)，也會(huì)出現(xiàn)倒峰，這就需要選擇合適的流動(dòng)相。如果流動(dòng)相中含有紫外吸收的雜質(zhì)，使用紫外檢測(cè)器時(shí)，無(wú)吸收的組分就會(huì)產(chǎn)生倒峰，因此必須用高純度的溶劑作流動(dòng)相。在死時(shí)間附近的尖銳峰往往是由于進(jìn)樣時(shí)的壓力變化，或者由于樣品溶劑與流動(dòng)相不同所引起的。

五、恒溫裝置

在HPLC儀中色譜柱及某些檢測(cè)器都要求能準(zhǔn)確地控制工作環(huán)境溫度，柱子的恒溫精度要求在±0.1~0.5℃之間，檢測(cè)器的恒溫要求則更高。

溫度對(duì)溶劑的溶解能力、色譜柱的性能、流動(dòng)相的粘度都有影響。一般來(lái)說(shuō)，溫度升高，可提高溶質(zhì)在流動(dòng)相中的溶解度，從而降低其分配系數(shù)K，但對(duì)分離選擇性影響不大；還可使流動(dòng)相的粘度降低，從而改善傳質(zhì)過(guò)程并降低柱壓。但溫度太高易使流動(dòng)相產(chǎn)生氣泡。

色譜柱的不同工作溫度對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)保留時(shí)間都有影響。在凝膠色譜中使用軟填料時(shí)溫度會(huì)引起填料結(jié)構(gòu)的變化，對(duì)分離有影響；但如使用硬質(zhì)填料則影響不大。

總的說(shuō)來(lái)，在液固吸附色譜法和化學(xué)鍵合相色譜法中，溫度對(duì)分離的影響并不顯著，通常實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行操作。在液固色譜中有時(shí)將極性物質(zhì)（如緩沖劑）加入流動(dòng)相中以調(diào)節(jié)其分配系數(shù)，這時(shí)溫度對(duì)保留值的影響很大。

不同的檢測(cè)器對(duì)溫度的敏感度不一樣。紫外檢測(cè)器一般在溫度波動(dòng)超過(guò)±0.5℃時(shí)，就會(huì)造成基線漂移起伏。示差折光檢測(cè)器的靈敏度和最小檢出量常取決于溫度控制精度，因此需控制在±0.001℃左右，微吸附熱檢測(cè)器也要求在±0.001℃以?xún)?nèi)。

六、數(shù)據(jù)處理和計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)

早期的HPLC儀器是用記錄儀記錄檢測(cè)信號(hào)，再手工測(cè)量計(jì)算。其后，使用積分儀計(jì)算并打印出峰高、峰面積和保留時(shí)間等參數(shù)。80年代后，計(jì)算機(jī)技術(shù)的廣泛應(yīng)用使HPLC操作更加快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、精密和自動(dòng)化，現(xiàn)在已可在互聯(lián)網(wǎng)上遠(yuǎn)程處理數(shù)據(jù)。計(jì)算機(jī)的用途包括三個(gè)方面：①采集、處理和分析數(shù)據(jù)；②控制儀器；③色譜系統(tǒng)優(yōu)化和專(zhuān)家系統(tǒng)。

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