高效液相色譜柱由柱管與填充的固定相填料組成，常用內(nèi)壁拋光的不銹鋼管作色譜柱的柱管以獲得高柱效。柱接頭將過(guò)濾片與色譜柱管連接。

概述

高效液相色譜法是19世紀(jì)60年代末期在經(jīng)典液相色譜法和氣相色譜法基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新型分離分析技術(shù)，在分析速度、分離效能、檢測(cè)靈敏度和操作自動(dòng)化方面取得了巨大的進(jìn)步，已在生物工程、制藥工業(yè)、食品工業(yè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、石油化工等領(lǐng)域獲得廣泛的應(yīng)用。

高效液相色譜柱是液相色譜系統(tǒng)獲得分離的核心部件，許多分離問(wèn)題都?xì)w結(jié)于色譜柱。不同類(lèi)型的色譜柱代表了不同的色譜方法。

高效液相色譜柱與經(jīng)典液相色譜柱相比，采用全多孔微粒固定相，裝填在小口徑的不銹鋼柱內(nèi)（長(zhǎng)度大幅縮短），在高壓環(huán)境下，溶質(zhì)的擴(kuò)散速度大大加快，從而在短的分析時(shí)間內(nèi)獲得高柱效和高分離能力。

高效液相色譜柱結(jié)構(gòu)及評(píng)價(jià)

高效液相色譜柱由柱管與填充的固定相填料組成，常用內(nèi)壁拋光的不銹鋼管作色譜柱的柱管以獲得高柱效。柱接頭將過(guò)濾片與色譜柱管連接，在色譜柱管的兩端要安裝過(guò)濾片，過(guò)濾片一般用多孔不銹鋼燒結(jié)材料，此燒結(jié)片上孔徑小于填料顆粒直徑，卻可讓流動(dòng)相順利通過(guò)，并可阻擋流動(dòng)相中的極小的機(jī)械雜質(zhì)以保護(hù)色譜柱。再用連接注螺帽、柱密封圈等將主接頭固定住。

在實(shí)際工作中，選擇性能良好的色譜柱可得到好的結(jié)果，首先要注意柱徑、長(zhǎng)度、填料種類(lèi)和填料粒度。評(píng)價(jià)一根色譜柱的主要指標(biāo)是：

（1）塔板數(shù)N值

直接關(guān)系到如何更好地分離樣品，僅適用于不拖尾的對(duì)稱(chēng)峰。

（2）峰不對(duì)稱(chēng)性

可用不對(duì)稱(chēng)因子AS測(cè)量，AS趨向于1是最好的。

（3）柱壓降

在滿(mǎn)足分離要求時(shí)，柱壓越低越合適。

（4）鍵合相濃度

如果濃度低表示未完全鍵合，則造成保留不能重復(fù)。

高效液相色譜柱分類(lèi)

不同種類(lèi)液相色譜柱的差異在于柱結(jié)構(gòu)、柱填料和柱尺寸的不同。

按色譜柱的尺寸（長(zhǎng)度和內(nèi)徑）可分為制備型、常規(guī)分析型和微型。

按柱填料類(lèi)型可分為：

（1）反相色譜柱，通常是在硅膠顆粒表面利用羥基活性鍵合烷基鏈（-C1、-C4、-C8、-C18等）或苯基（-Ph）等生成非極性鍵合固定相，以C18（ODS）使用最為廣泛。由于硅膠基質(zhì)的在堿性條件下可能造成柱床塌陷，市場(chǎng)上已有有機(jī)硅膠/無(wú)機(jī)硅膠混合基質(zhì)的反相色譜柱（如YMC-Triart系列反相柱）與有機(jī)聚合物基質(zhì)的反相色譜柱（如YMC Polymer C18）。

（2）正相色譜柱，通常使用球形硅膠顆粒作為填料，或?yàn)楦纳品蛛x性能而硅膠顆粒表面鍵合腈基（-CN）、胺基（-NH2）、醚基（-O-）生成極性鍵合固定相。

（3）離子交換色譜柱，在硅膠或聚合物表面引入陽(yáng)離子交換基團(tuán)或陰離子交換基團(tuán)。

（4）體積排阻色譜柱，以凝膠為填料，要依據(jù)分子尺寸大小的差異來(lái)進(jìn)行分離。

（5）手性色譜柱，用于分離手性異構(gòu)體。

（6）親和色譜柱，固定相由基體、間隔臂和配位體三部分構(gòu)成。

高效液相色譜柱日常維護(hù)與保養(yǎng)

色譜柱的使用壽命，除了與所分析的樣品和流動(dòng)相及使用頻率有關(guān)外，最主要的是與日常的維護(hù)密切相關(guān)。

色譜柱的使用壽命主要是根據(jù)柱效和柱壓兩個(gè)指標(biāo)來(lái)衡量，如果一根色譜柱的柱效太低或柱壓太高，通常被認(rèn)為該色譜柱的使用壽命已經(jīng)結(jié)束。因此，延長(zhǎng)色譜柱使用壽命的關(guān)鍵是，消除引起柱效下降和柱壓升高的因素。以下是色譜柱的日常維護(hù)方法;

1、流動(dòng)相的pH應(yīng)在色譜柱所規(guī)定使用范圍內(nèi)

流動(dòng)相超過(guò)色譜柱所能承受的pH范圍將會(huì)導(dǎo)致硅膠基質(zhì)流失和鍵合相碳鏈斷裂，使柱效下降，使用壽命變短。由于流動(dòng)相的pH控制不當(dāng)而對(duì)色譜柱造成的損害，通常很難使色譜柱恢復(fù)，因此必須認(rèn)真對(duì)待，嚴(yán)格控制流動(dòng)相的PH值

2、使用保護(hù)住和流路過(guò)濾器

樣品和流動(dòng)相中含有的固體顆粒物質(zhì)會(huì)堵塞色譜柱篩板，篩板被堵不僅會(huì)引起柱壓的升高，而且也會(huì)引起柱效下降，因?yàn)楹Y板的堵塞會(huì)引起液流不均，導(dǎo)致色譜峰形拖尾、變寬，從而使柱效下降。保護(hù)柱和在線過(guò)濾器上都有篩板，可以阻止固體顆粒物質(zhì)到達(dá)色譜柱，防止堵塞色譜柱篩板。由于柱壓升高在分析故障中占很大比例，因此，除對(duì)樣品和流動(dòng)相進(jìn)行過(guò)濾外，建議在色譜柱進(jìn)樣端上加上保護(hù)住和在線過(guò)濾器。

如果確認(rèn)色譜柱柱壓升高是由于進(jìn)樣端篩板被堵引起的，針對(duì)反相色譜柱可選擇以下方式使柱壓恢復(fù)正常：

1）先在色譜柱前加上保護(hù)住或在線過(guò)濾器，然后用甲醇/水=20/80 1.0ml/min反向沖洗色譜柱180min。

2）先在色譜柱進(jìn)樣端加上保護(hù)柱或在線過(guò)濾器，然后反向使用。

3、正確使用緩沖鹽溶液

通常緩沖鹽易溶于水，難溶于有機(jī)溶劑，因此緩沖鹽使用不當(dāng)會(huì)使其析出，堵塞填料基質(zhì)的微孔和顆粒間的空隙，使填料板結(jié)，柱壓上升；同時(shí)阻礙了基質(zhì)上鍵合的碳鏈難以舒展，使色譜柱的保留能力下降，柱效降低。緩沖鹽析出后，去除非常困難，因此，正確的使用緩沖鹽對(duì)延長(zhǎng)色譜柱使用壽命非常重要。

緩沖鹽的正確使用方法：

1）等度條件：使用緩沖鹽之前和之后都用過(guò)渡流動(dòng)相以1.0ml/min流速各沖洗60min。

2）梯度條件：使用緩沖鹽前用與初始流動(dòng)相組成相同的過(guò)渡流動(dòng)相以1.0ml/min流速各沖洗60min,梯度設(shè)定盡量平緩，以避免梯度過(guò)程中緩沖鹽析出；

注意：過(guò)渡流動(dòng)相是指有機(jī)相和水相的比例與分析流動(dòng)相相同，只是過(guò)渡流動(dòng)相中不含緩沖鹽。

3） 緩沖鹽溶液不能存留于色譜柱中過(guò)夜。

4）緩沖鹽析出的補(bǔ)救方法：

方案1：用甲醇/水=20/80以1.0ml/min流速35℃條件下反向沖洗色譜柱120min；

方案2：用甲醇/水=20/80以0.2ml/min流速反向沖洗色譜柱過(guò)夜。

4、防止強(qiáng)保留物質(zhì)存留在色譜柱中

強(qiáng)保留物質(zhì)和大分子化合物在色譜柱中累積，對(duì)樣品中的化合物產(chǎn)生額外的保留行為，不僅引起峰形變寬、拖尾，使柱效下降，同時(shí)也會(huì)引起保留時(shí)間的變化，累積到一定程度時(shí)還會(huì)導(dǎo)致柱壓升高。

由于強(qiáng)保留物質(zhì)和大分子化合物對(duì)色譜分離的影響是一個(gè)累積效應(yīng)，需要一定的時(shí)間才會(huì)體現(xiàn)出來(lái)，但對(duì)許多樣品特別是復(fù)雜樣品我們不知道是否含有強(qiáng)保留物質(zhì)，因此要防止強(qiáng)保留物質(zhì)的累積，需要在每一天的日常維護(hù)中，用純甲醇或乙腈清洗。

清洗方法：

1）未使用緩沖鹽：每天分析完后，用純甲醇或純乙腈反沖洗色譜柱60min。

2）使用過(guò)緩沖鹽：分析完后，先用上述方法除去緩沖鹽，然后再用純甲醇或乙腈反向沖洗色譜柱60min。

3）補(bǔ)救方法：用純甲醇或乙腈反向沖洗180min。

常見(jiàn)故障及解決方法

選擇了一根好的柱子，再加上有效的維護(hù)與預(yù)防，可以避免不少意外故障的發(fā)生。但誰(shuí)也不能保證色譜柱“永遠(yuǎn)”不出故障，任何一根色譜柱最終都會(huì)柱效柱直至報(bào)廢。損壞的標(biāo)志：

①塔板數(shù)下降；

②峰形變壞；

③壓力增加；

④保留時(shí)間變化。

有時(shí)往往是幾種情況伴隨著同時(shí)發(fā)生。

1、塔板數(shù)下降

在色譜柱使用過(guò)程中，塔板數(shù)會(huì)不斷下降。一般情況下，進(jìn)2000個(gè)樣品后柱效N值要降低50%（但也不能一概而論）。如果柱效下降很快或突然下降，應(yīng)考慮柱頭塌陷或進(jìn)了不合格的樣品。

2、峰形變壞

出現(xiàn)峰拖尾、分叉峰或非高斯峰的原因很多，但總是與塔板數(shù)驟然下降聯(lián)系在一起的，峰形變壞而保留時(shí)間不變，多半是柱受到阻塞（不銹鋼燒結(jié)片），或者柱頭有了空穴。

3、壓力增加

和柱塔板數(shù)不斷減少一樣，在使用過(guò)程中柱壓慢慢增加，可視為正常。如果壓力很快增加過(guò)高，應(yīng)考慮兩種可能，二是樣品沉積在柱內(nèi)，而是柱內(nèi)硬件阻塞。

對(duì)于第一種情況，要用溶解所用樣品的溶劑沖洗，沖洗時(shí)拆開(kāi)柱與檢測(cè)器之間接頭，以防污染檢測(cè)器流通池。如沖洗無(wú)效，應(yīng)考慮是第二種情況，先更換燒結(jié)不銹鋼過(guò)濾片。換濾片時(shí)盡量不要攪動(dòng)柱頭填料，如有塌陷，可用同種填料加乙醇調(diào)成糊狀補(bǔ)平柱頭，壓緊，壓平，柱性能可能恢復(fù)如前。如果柱頭填料已臟，可挖去2-3mm，用新填料填平。

4、保留時(shí)間的改變

保留時(shí)間的變化有兩種類(lèi)型的情況，一是同一根色譜柱樣品間的保留變化，二是不同柱之間的保留變化。對(duì)于第一種情況，在排除流動(dòng)相比例和pH值的差異以及流速差異所引起的保留變化外，再確認(rèn)色譜柱中是否有強(qiáng)保留的物質(zhì)殘留，如有殘留，請(qǐng)用強(qiáng)溶劑沖洗。第二種情況主要是由于生產(chǎn)廠家提供的色譜柱批次之間的差異所引起的，如果保留時(shí)間變化不大，可通過(guò)微調(diào)流動(dòng)相或流速來(lái)解決，如果對(duì)于保留時(shí)間的再現(xiàn)性有特別要求，請(qǐng)?jiān)谫?gòu)買(mǎi)之前向供應(yīng)商說(shuō)明，以選購(gòu)質(zhì)量可靠的產(chǎn)品。

參考資料

1、色譜技術(shù)叢書(shū)，化學(xué)工業(yè)出版社

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